Microscopio (strumento ottico)

thumb|right|300px|Modello di microscopio del 1913

Il microscopio è lo strumento che consente di osservare oggetti piccoli e vicini a forte ingrandimento.

Il microscopio

Potere risolutivo

L'occhio umano ha un potere risolutivo di 0,025-0,1 mm, quindi significa che ad occhio nudo possono essere distinti come separati, due punti che si trovino ad una distanza tra loro di almeno 1/10-1/40 di mm; se la distanza è inferiore i due punti non possono essere più distinti e vengono confusi in uno solo.
Da qui la necessita di uno strumento che permettesse di scoprire il mondo dell'infinitamente piccolo: il microscopio.

Costituenti del microscopio

Ogni microscopio ha come costituenti fondamentali un obiettivo ed un oculare.
La distanza tra oculare e oggetto dell'osservazione è invariabile in qualsiasi tipo di microscopio, la messa a fuoco dell'oggetto avviene attraverso spostamento del sistema ottico utilizzato.
L'oggetto (o preparato o provino), viene per lo più ridotto in una lamina sottile e posto su una lastrina di vetro (vetrino) ed illuminato dal basso tramite un condensatore ottico (illuminazione per trasparenza o a campo chiaro) oppure lateralmente (illuminazione in campo scuro). Per ottenere una maggiore risoluzione può essere aggiunto, tra il preparato e l'obiettivo, un liquido rifrangente (obiettivo a immersione).

Ingrandimento

L'ingrandimento G è dato dalla formula

$G= \frac{\Delta}{f_2} : \frac{f_1}{f_1 f_2} = \frac{a \Delta}{f_1 f_2}$

dove a è la distanza tra i due fuochi compresi tra l'obiettivo e l'oculare, f₁ e f₂ le distanze focali dell'obiettivo e dell'oculare. L'ingrandimento cresce se si riducono le distanze focali. L'ingrandimento dipende anche dalla acutezza visiva del singolo osservatore.

Potenza

La potenza P di un microscopio è pari a:

$P = \frac{G}{\Delta} = \frac{a}{f_1 f_2}$

La potenza è indipendente dalle capacità dell'osservatore.

Potere separatore

La visione distinta di oggetti sempre più piccoli non può essere ottenuta solamente aumentando il potere di ingrandimento. La diffrazione pone un limite inferiore alla distanza di separazione tra due punti in posizioni distinte.
Questa distanza minima è data da

l m i n = 1,2λ / 2 n sinα

dove λ è la lunghezza d'onda della luce che illumina l'oggetto, n l'indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e obiettivo, α il semiangolo del cono di raggi utili che ha il vertice nel centro dell'obiettivo.
Per la luce bianca il limite è di 1/3.636 mm, per quella violetta 1/4.564 mm.
Per aumentare il potere risolutivo, si utilizzano sorgenti di luce ultravioletta, che non agiscono più sull'occhio ma su una lastra fotografica. In questo caso vengono utilizzati obiettivi al quarzo, ottenendo una separazione di due punti distanti fra loro un decimilionesimo di millimetro.

Storia del microscopio

Il primo risultato fu il microscopio ottico, una lenta elaborazione e a volte di scoperte casuali, ad opera di scienziati ed anche di semplici artigiani.
La proprietà di lenti e di specchi erano conosciute fin dall’antichità, ma non furono mai oggetto di studio sistematico.
Gli stessi problemi che bloccarono gli sviluppi del cannocchiale, impedirono anche il progresso della microscopia, legato a quello dell'ottica.
I maggiori esponenti di questo progresso sono Galilei, Cornelius Drebbel, Anthonie van Leeuwenhoeck, Robert Hooke.La teoria progredì rapidamente, ma non altrettanto la pratica. Per molti secoli lo strumento più usato fu il microscopio semplice, mentre quello composto, sebbene migliore, fu per molto tempo non concorrenziale a causa della difficoltà di costruzione e dei difetti delle lenti.
Solo i perfezionamenti introdotti da Giovanni Battista Amici e da Ernst Abbe permisero di cambiare la situazione.
I progressi della tecnica portarono poi ai microscopi a raggi X e a quelli elettronici.

thumb|right|300px|Microscopio usato per le colonie batteriche Tipi di microscopio:

microscopio semplice a luce trasmessa
microscopio composto a luce trasmessa
microscopio a fluorescenza
microscopio a contrasto di fase
microscopio ad interferenza
microscopio polarizzatore
ultramicroscopio
microscopio a riflessione
microscopio a raggi X
microscopio elettronico
microscopio acustico
microscopio confocale o microscopio a scansione a doppia focalizzazione

Microscopio semplice a luce trasmessa

È costituita da una lente d'ingrandimento munita di sostegno. L'oggetto da osservare viene posto su un altro sostegno, forato, per permetterne l'illuminazione dal basso.
L'ingrandimento è dato dalla formula

I= 25/f

25 = distanza della visione distinta, f = distanza focale della lente; le misure sono in centimetri.
La formula è valida solo per piccole distanze focali.

Microscopio composto a luce trasmessa

Si compone di:

stativo, il supporto meccanico che comprende anche le viti macrometrica e micrometrica per la messa a fuoco
apparato di illuminazione
obiettivo
oculare.

L'obiettivo e l'oculare sono le due lenti che permettono l'ingrandimento. L'obiettivo è quello vicino all'apparato ed è l'elemento chiave del microscopio, in quanto l'oculare può solo ingrandire quanto risolto dall'obiettivo. Conseguenza ovvia il potere risolutivo di un microscopio a luce trasmessa dipende dall'obiettivo.
L'obiettivo fornisce un'immagine reale, capovolta e ingrandita. Se il mezzo interposto tra obiettivo ed oggetto è l'aria si dice a secco altrimenti ad immersione in un liquido. I liquidi più utilizzati sono l'acqua, l'olio di cedro e la monobromo naftalina.
Molto importante è l'illuminazione del soggetto e dalla lunghezza d'onda della luce.
Usando luce bianca normale, con lunghezza d'onda media di 5.500 Å (1/10.000.000 di mm), l'obiettivo può evidenziare oggetti con un diametro di 2.750 Å.

Microscopio a fluorescenza

Questo tipo di microscopio utilizza radiazioni ultraviolette, per ottenere, nei preparati in cui ciò è possibile, la fluorescenza.

Microscopio a contrasto di fase

Questo tipo di microscopio sfrutta la differenza di fase in cui i raggi luminosi vengono diversamente ritardati dalle strutture del preparato in esame.
Con questo microscopio, le cellule possono essere osservate senza bisogno di colorazione e quindi le cellule allo stato vivente, senza alcun tipo di alterazione conservativa.
Questo tipo di microscopio permette la tecnica della cinematografia accelerata, con cui si può osservare un fenomeno vitale in successioni costanti di tempo, come la moltiplicazione cellulare. Non permette comunque ingrandimenti maggiori di quelli a luce trasmessa.

Il principio si basa su alcuni principi dell'ottica moderna. Considerando un reticolo costituito da fili rettilinei, paralleli ed equidistanti, investito da una radiazione luminose da una sorgente A, avverranno dei fenomeni di diffrazione. Queste verranno raccolte dal microscopio come tante immagini A' della sorgente, quante sono le onde difratte. Tutte queste immagini (centri di onda) si trovano sul piano dove dovrebbe trovarsi l'unica immagine in assenza di reticolo.
Dai centri di onda, le onde difratte proseguono, si intersecano e danno luogo a processi di interferenza, formando l'immagine del reticolo.
Se si sostituisce al reticolo normale, un reticolo di fase, costituito da materiale solido e trasparente, in cui il compito dei fili sia assolto da tratti di materiale più spesso, i fenomeni di diffrazione avverranno comunque. A causa della differenza di spessore, avvengono anche delle alterazioni di fase. Dai centri di onde, continuano a partire onde che danno luogo ad interferenza, ma i vari sistemi di frange risultano spostati e l'oculare non riesce a cogliere la visione di un campo uniformemente illuminato.
Cambiando la fase di alcuni dei campi di A', le frange si sposteranno rendendosi visibili. Il risultato fu ottenuto da Frits Zernike, che per questo ottenne il premio Nobel (1953). Inserì sul piano dei centri A' una lamina, trasparente e mobile, che in una zona aveva uno spessore maggiore: i centri A' che si trovavano in questa zona variavano nuovamente la loro fase. Un provino trasparente, composto da diverse sostanze, si comporta come un reticolo di fase, per cui mediante la lamina di Zernicke è possibile l'osservazione delle sostanze presenti.

Microscopio ad interferenza

Si basa sullo stesso principio del contrasto di fase, ma si attua con due onde: una attraversa il preparato che, se non è omogeneo, deforma l'onda, che si incontra con la seconda onda non deformata, dando luogo a fenomeni di interferenza. Queste forniscono notizie utili sulle sostanze presenti nel provino.

Microscopio polarizzatore

È munito di due prismi di Nicol oppure di filtri polarizzatori. Il nicol polarizzatore invia sull'oggetto un fascio di luce polarizzata, mentre il nicol analizzatore è posto tra obiettivo e oculare, in modo che possa ruotare. Quando i piani di polarizzazione trai i due nicol sono incrociati ad angolo retto, il campo dello strumento appare scuro, tranne che nelle zone corrispondenti a sostanze birifrangenti o dotate di potere rotatorio.
Questo tipo di microscopio è utilizzato in mineralogia e in petrografia per studiare minerali e rocce preparati in sezioni sottili.
Osservazioni eseguite con un solo nicol o con nicol paralleli, rivelano l'esistenza di eventuale pleocroismo.

Ultramicroscopio

Nell'ultramicroscopio, un particolare tipo di condensatore, detto cardioide, esclude l'obiettivo dall'azione diretta della sorgente luminosa. Il provino può essere illuminato intensamente ed osservato in campo scuro.
Del provino non si vede la forma, ma una centrica in corrispondenza del punto ove si dovrebbe trovare l'immagine di ogni particella.
Si tratta di una osservazione indiretta, ma utile quando si voglia conoscere il numero e il tipo di moto delle particelle.

Microscopio a riflessione

In questo microscopio l'obiettivo è composto da una serie di specchi.
La sua forma più semplice prevede uno specchio concavo che riflette l'immagine su uno specchio convesso e da qui all'oculare.
Questo sistema funzione anche con radiazione non visibile, come l'infrarosso e l'ultravioletto, quindi la visione può essere effettuata anche senza l'apporto dell'occhio umano, ma per mezzo di una lastra fotografica.
Il microscopio a riflessione permette l'utilizzo di distanze focali di gran lunga maggiori rispetto a quelle di altri microscopi, quindi il suo campo di applicazione è molto vasto e, in un certo senso, sussidiario a quello di altri microscopi.

Microscopio a raggi X

Un sottile fascio di elettroni, con velocità uniforme, viene fatto incidere su un bersaglio che emette raggi X. I raggi si allargano a fascio e attraversano il provino, subendo un diverso assorbimento a seconda dei costituenti del provino stesso. I raggi provenienti da provino, vengono raccolti su una lastra fotografica
L'ingrandimento non è eccezionale, non supera normalmente le 40 volte, ma la lastra può essere ingrandita al microscopio ottico, fino ad un massimo di 300 volte, oltre questo ingrandimento la granulosità dell'emulsione della lastra comincia a creare dei problemi.
Il metodo è utilissimo per osservare materiali non trasparenti ed è particolarmente usato nell'industria per il controllo dei materiali.

Microscopio elettronico

Microscopio elettronico a trasmissione

Nel microscopio elettronico a trasmissione si utilizza un fascio di elettroni come per il microscopio a raggi X. Gli elettroni vengono concentrati da un condensatore magnetico sul provino. Nel materiale in esame avvengono fenomeni di diffrazione, che raggiungono l’obiettivo, anch'esso magnetico, quindi ad un proiettore che invia l'immagine ad una schermo fluorescente.
Quindi condensatore, obiettivo e proiettore non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse.
La sorgente è spesso costituita da un filamento di tungsteno, il cui potenziale è negativo e mantenuto tra i 30 e i 10 kV. Variando l’intensità della corrente nel circuito del condensatore si varia anche l’intensità e la convergenza del fascio elettronico incidente. Con la variazione di quella del proiettore si regola l'ingrandimento, mentre variando quella dell'obiettivo si migliora la nitidezza.
L'ingrandimento dipende essenzialmente dall’intensità di corrente che percorre le bobine del proiettore.
Se sono forniti di un cannone elettronico da 1 MV hanno un potere risolutivo compreso tra 2 e 5 Å ed ingrandimento fino a 10⁶ diametri.

Microscopio elettronico a diffrazione

È un tipo di microscopio analogo al precedente ed è costituito da un tubo a raggi catodici. I raggi vengono difratti dall'oggetto e raccolti su una lastra fotografica. L'immagine ottenuta viene analizzata con un apparecchio ottico ricombinatore.

Microscopio elettronico a scansione

Funziona in un modo analogo ad un sistema televisivo a circuito chiuso. La superficie del campione viene colpita da un fascio di elettroni, che esplora la superficie per mezzo di una bobina deflettrice, muovendosi come su uno schermo televisivo (il numero di righe per quadro è regolabile, tra 100 e 1.000). Gli elettroni secondari generati punto per punto dalla superficie vengono raccolti da un elettrodo collettore a 200 V. L'elettrodo produce un segnale elettrico, che modula i fascio elettronico sullo schermo, percorso in sincronia col fascio primario: sullo schermo si forma così una immagine avente grande profondità di fuoco.

Microscopio elettronico ad emissione di campo

Un tipo particolare di microscopio elettronico è quello ad emissione di campo. Fu impiegato per la prima volta da E. W. Müller (1936).
Sfrutta l'emissione dal provino di ioni positivi o altri elettroni, che vengono raccolti su uno schermo fluorescente.
Con l'emissione di campo si ottengono un milione di ingrandimenti. Il potere risolutivo è di circa 20 Å. Nel caso specifico di microscopi elettronici di campo ionico, scende a 2,4 Å.

Microscopio a forza atomica

Con il microscopio a forza atomica, invece della corrente di tunneling, si registra il gradiente di forza repulsiva che si genera tra le nubi elettroniche della punta e gli elettroni sulla superficie del campione.
La superficie della sonda esercita una pressione sul campione e quindi la tecnologia utilizzata può essere distruttiva, rendendo più utile il microscopio a effetto attrattivo, che, anziché la forza repulsiva, utilizza quella attrattiva tra superficie del campione e punta della sonda, che non tocca il campione.

Microscopio acustico

Un trasduttore piezoelettrico genere un fascio parallele di ultrasuoni a partire da un opportuno segnale elettrico. Gli ultrasuoni utilizzati hanno lunghezza d'onda di un µm e frequenza di un GHz (un miliardo di Hertz). Il fascio si propaga in uno zaffiro, a contatto con il liquido (in genere acqua, più raramente argon liquido) in cui è immerso l'oggetto da esaminare.
La superficie di separazione tra zaffiro e liquido è lavorata in forma di semisfera (una decina di µm di diametro) incavata nello zaffiro, ottenendo così una lente acustica che converge il fascio sonico sul piano focale dove è posto l'oggetto. Il fascio colpisce l'oggetto e ritorna all'indietro e viene convertito in un segnale elettrico che verra' utilizzato per ricostruire l'immagine ingrandita

Microscopio confocale

Il principio di questo microscopio fu brevettato da Marvin Minsky nel 1961, ma venne sfruttato solo dopo il 1980.
Viene utilizzato per l'esame di un campione di un certo spessore, in quanto permette di analizzare ad alta risoluzione piani al di sotto della superficie. Categoria:Ottica